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            有助于提高蛋白表達目的的實驗方案

            發布時間:2022-01-19   點擊次數:221次
              克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理,同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是目前應用廣泛的蛋白表達系統,其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統,表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。本實驗中,攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BlL21中,在37℃,IPTG誘導下,超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素?;D移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質加以提純,實為金屬熬合親和層析(MCAC)。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。
              有助于提高蛋白表達目的的實驗方案:
              1.降低蛋白合成的速度??梢酝ㄟ^以下方法實現:
              a.降低培養溫度b.使用弱啟動子。
              c.使用低拷貝數的質粒表達載體d.降低誘導物的濃度。
              e.在比較高的菌密度進行較短的時間誘導。
              2.改變培養基。
              a.培養基中加入可以幫助蛋白折疊的因子。
              b.加入緩沖液保持pH穩定c.加入1%的葡萄糖,抑制lac啟動子。
              d.加入山梨糖醇等可以穩定蛋白天然結構的因子。
              e.加入乙醇,thiols and disulfides等。
              3.分泌表達。使目的蛋白分泌到周質空間。
              周質空間的氧化性的環境有利于二硫鍵的形成,而胞內則是還原性的。周質空間有折疊酶DsbA和DsbC的存在,幫助蛋白正確折疊。
              周質空間很少有蛋白酶存在,不會被水解。
              可以使對細胞有毒性的蛋白大量存在。
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